糖蛋白在人体蛋白质中占比超过50%，并且是大多数生物制药的关键成分。作为一种复杂且广泛的翻译后修饰（PTM），蛋白质糖基化对于调控各种生物过程具有重要意义。深入分析糖蛋白的一级序列，包括糖基化位点的识别和糖链结构的特征，是探索其功能的关键。液相色谱-质谱法（LCMS/MS）已经成为识别蛋白质和发现翻译后修饰的有效工具。

与通常在糖蛋白质组学中使用的数据库搜索策略不同，蛋白质的从头测序是一种新兴方法，不需事先了解DNA或氨基酸序列。然而，多糖基化位点的复杂性常常导致序列覆盖不完整，游离寡糖修饰谱不明，使得获取丰富信息的糖肽碎裂谱变得困难。这种广泛的糖基化现象在某些区域形成间隙，从而限制了从头测序在具有一致结构和已知N-连接糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中的应用。

在2025年发表的文章《Decoding Protein Glycosylation by an Integrative Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing Strategy》中，研究人员提出了一种结合糖基释放介导的从头测序与糖基化位点表征的全新质谱法。这种方法的创新性在于利用N-/O-糖的去糖基化技术实现了全面的序列覆盖，并结合EThcD片段化技术，有效地鉴定出高质量的长肽，从而促进了准确的蛋白质组装。该研究进一步验证了此方法在复杂糖基化融合蛋白依那西普及三种序列未知的新型肿瘤坏死因子受体：Fc融合生物制剂的应用，揭示了其一级序列的细微差异。

在该研究中，作者采用N-糖苷酶F（PNGase F）去除N-聚糖，以及内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，并结合唾液酸酶以确保去糖基化效果。完整质量分析进一步确认了去糖基化的成功。随后，采用电子转移高能碰撞解离（EThcD）技术获取高质量的肽段，应用PEAKS AB进行序列分析。接着，在含有18O的环境下，利用PNGase F将糖基化的Asn转化为Asp，并标记18O进行定量分析，以识别N糖基化位点。

通过内切糖苷酶混合物的处理，作者分析了糖苷酶处理后的质谱数据，验证了带有“GlcNAc”或“GlcNAc-Fuc”修饰的产物，从而验证了N-糖基化位点的鉴定结果。

综上所述，基于质谱的蛋白质从头测序提供了一种强有力的工具，能够揭示氨基酸序列并提升糖基化表征的准确性。这种新策略为深入研究高度糖基化蛋白质开辟了新途径。作者对依那西普的分析不仅提供了全面的信息，并解析了氨基酸序列及糖基化位点，还阐述了糖型异质性的复杂性。考虑到在CHO细胞系中表达的蛋白质中N-/O-糖基化的共性，这项研究为成功分析多种生物药物奠定了基础，助力于治疗多种疾病。

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